原核体系操作流程概述

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原核体系操作流程概述 



主要步骤

操作

 

制备载体

1. 用限制性酶消化,去磷酸化,或使用LIC 载体

2. 胶纯化(或使用LIC载体)

 

制备插入 DNA

1. 质粒纯化/PCR

2. 限制性消化或制备 LIC 粘端

3. 胶纯化


 

将插入片段克隆到载体上

1. 插入片段与 pET 载体连接或退火

2. 转化非表达型宿主菌(例如NovaBlue)

3. 筛选阳性克隆;菌落PCR,制备质粒DNA,通过测序确定阅读框,或进行体外转录/翻译

  

转化表达宿主菌

1.热激转化

2.平板抗生素筛选

 

诱导/优化表达目的蛋白

1.扩大培养

2.IPTG诱导

 

 

目的蛋白纯化

1. SDS-PAGEWestern印迹,确定目的蛋白

2.湿菌破碎,制备粗提蛋白

3.亲和纯化

4.其他纯化方法提高纯度(如果必要)

5.切去融合标签并去除蛋白酶(如果必要)


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