技术服务


凝胶迁移实验(EMSA)实验服务

凝胶迁移实验又称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA),是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术,可用于定性和定量分析。目前已用于研究DNA结合蛋白和特定的DNA序列的相互作用,是转录因子研究的经典方法。

其原理是基于DNA结合蛋白与DNA的特异性结合,依据实验需要,设计标记探针、非标记探针、蛋白特异性抗体等参照物,通过电泳迁移率的变化来进行定性和定量分析。


我们的优势

l 自建的蛋白表达平台,方便的获得诱饵蛋白;

l 直接测定蛋白质与核酸的相互作用,提供定性和定量信息。

l 可用于研究多种类型的相互作用,如特异性结合、非特异性结合、序列特异性等。

技术简单,实验操作相对容易。

l 可以使用不同的标记方法和检测技术进行适应不同实验需求。



EMSA实验流程

根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与蛋白样本混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物,这种复合物由于分子量大,在进行PAGE电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则迁移较快。孵育的样本在进行PAGE电泳并转膜后,蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带,说明有蛋白与目标探针发生互作。

EMSA实验流程1.jpg


  EMSA的应用

1、验证型EMSA

用于验证探针是否含有可与蛋白质结合的位点。将结合位点突变,以突变探针为对照,野生型探针出现迁移条带,而突变探针未出现迁移条带,则说明该探针含有可与蛋白质结合的位点。

2、竞争型EMSA

探针序列不变,不含修饰基因的探针称为冷探针。冷探针与标记探针竞争性的与蛋白结合,冷探针不显示影出迁移条带。以冷探针为对照,标记探针出现迁移条带,而冷探针迁移条带减弱或消失,则排除了假阳性干扰,增加实验结果准确性。

3、超迁移EMSA

使用目标蛋白的特异性抗体,蛋白探针复合物被抗体识别并结合,该三聚复合物在凝胶电泳中,迁移速率再次增大,出现在蛋白探针复合物的上方的超迁移条带,验证了探针与目的蛋白的特异性结合。


EMSA服务内容


服务内容

服务说明

周期

交付

价格

5'生物素(biotin)探针合成

探针标记及合成  (≤59bp)

1-2周

1、分析报告

2、探针设计合成信息;
3、实验原始图片

咨询客服免费询价

探针标记及合成  (60bp-300bp)

2-3周

EMSA实验

验证性EMSA:验证生物素标记探针与结合蛋白互作的EMSA

1-2周

竞争性EMSA:生物素标记探针、非标记探针与结合蛋白互作的EMSA

超迁移EMSA:特异性抗体进一步鉴定探针与蛋白结合物的EMSA

 

注:如果客户提供序列,由碣石负责蛋白的制备,最终在交付分析报告的同事,也会交付>85%纯度的蛋白、质粒、菌株以及对应的蛋白报告


EMSA服务样品要求


样品类型

样品需求

保存条件

运输条件

备注

探针

探针序列

如无探针序列,请提供DNA结合蛋白相关信息或相关文献,便于碣石生物技术人员设计探针

-20℃

冰袋

所有样本均须有唯一标记,且标记清晰可识

动植物组织

1、单个样品>2g,EP管或冻存管装。

2、样本应尽量新鲜

3、冻存样本避免反复冻融以致降解。

-80℃

干冰

贴壁/悬浮细胞

细胞至少5*107个/份,常温离心收集细胞。-80℃保存。

-80℃

干冰

核蛋白或转录因子

细胞核蛋白或纯化的转录因子,部分实验亦可使用重组表达的蛋白,依据实验设计每张膜至少提供50ul,浓度大于0.5mg/ml

-80℃

干冰

抗体

结合蛋白特异性抗体50μL以上,浓度大于0.5mg/ml

-80℃

干冰

质粒

1、>20μg

2、测序结果;

3、EP管上标明抗性。

-20℃

冰袋

大肠甘油菌

1、>500μL

2、测序结果;

3、EP管上标明抗性。

4、三个月内,活性较好的菌。

-20℃

冰袋

 

EMSA 的优点


优点

缺点

容易掌握,简单易行,实验要求条件不苛刻,可以适应一定范围内的反应条件变动;

无法衡量电泳过程中的化学平衡,在电泳过程中发生的快速解离会影响对复合物的检测;

同位素标记探针具有非常短的半衰期并且对人的健康有害,而生物素标记更稳定、准确和方便,且亲和力高;

EMSA实验中,复合物的形成与许多因素有关,并不能直接反映分子大小或者鉴定复合物中的各种蛋白质;

该技术可以检测的核酸分子大小和结构(单链、双链、三链、四链、环状核酸)范围很广,并可提供蛋白结合在核酸上的准确序列位置;

EMSA在很大程度上属于定性实验,比如:可以检测蛋白-DNA复合物的形成与否,并不能精细的检测结合反应的上调或下调;

在合适的条件下,在单个反应体系中就可以通过不同复合物的形成,检测不同蛋白与不同核酸分子之间的结合情况;

实验中并不考虑体内环境中影响蛋白DNA结合的因素,比如染色质的结构对复合物形成的影响,因此即使EMSA实验结果反映蛋白可以与DNA结合。

能检测的蛋白大小范围很广,从寡肽到转录因子复合物都能检测,并且该实验既可以使用纯蛋白也可以使用细胞提取物。



 



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